Las velocidades de evolución de IDPs son modeladas por los ensembles conformacionales (*)

El estado nativo de las proteínas está compuesto por múltiples confórmeros que se encuentran en un equilibrio dinámico. En conjunto, todas estas estructuras forman lo que se conoce como ensemble nativo (Wei, Xi, Nussinov, Ma, 2016). Para el caso de proteínas globulares (conocidas como “ordenadas”) o dominios globulares, las barreras energéticas presentes para las transiciones entre los distintos confórmeros son relativamente altas, permitiendo de esta manera explorar, mediante distintos métodos y técnicas experimentales, conformaciones discretas y bien establecidas (Monzon, Rohr, Fornasari, Parisi, 2016).

En un extremo del continuo estructural del espacio conformacional de las proteínas, se pueden encontrar confórmeros que presentan pequeñas diferencias estructurales entre ellos (comportamiento típico de proteínas llamadas rígidas) donde movimientos pequeños o rotaciones en residuos que no involucran traslaciones a nivel del esqueleto carbonado permiten la llegada de ligandos al sitio activo de la proteína, la apertura de túneles, o el alargamiento de cavidades (Monzon et al., 2017). Los movimientos en loops, el desplazamiento de elementos de estructura secundaria y la rotación de dominios contribuyen al incremento de las diferencias estructurales entre confórmeros (Gerstein, Krebs, 1998).

En el otro extremo del continuo estructural se encuentran las IDPs, que presentan una alta plasticidad y barreras energéticas bajas entre los distintos confórmeros (Berlow, Dyson, Wright, 2015). Las características distintivas de este conjunto de proteínas no suponen una restricción para su distribución en los distintos reinos y taxas. Por ejemplo, aproximadamente el 40% de los proteomas de eucariotas (Lobanov, Galzitskaya, 2015) y aproximadamente el 46% de entradas de Uniprot (The UniProt Consortium, 2017) contienen regiones desordenadas cortas (Necci, Piovesan, Tosatto, 2016). Más aún es bien conocido el hecho que estas proteínas juegan un rol crucial en muchas enfermedades neurodegenerativas y en desórdenes sistémicos (Uversky et al., 2009).

Tanto para las proteínas globulares (u ordenadas) como para las IDPs, el concepto del ensemble estructural nativo es clave para dos explicaciones alternativas sobre la descripción de una serie de eventos complejos relacionados con la unión a ligando (Nussinov, Ma, Tsai, 2014 ). Estas dos explicaciones son el modelo de selección conformacional (de pre-equilibrio) y el modelo de encaje o ajuste inducido. Brevemente, en el modelo de selección conformacional un conjunto de conformaciones que se encuentran pobremente representadas puede presentar una alta afinidad para un determinado ligando biológico. Los eventos de unión producen un cambio en el equilibrio conformacional que produce un incremento en la concentración relativa de estas conformaciones competentes, fenómeno denominado population shift. Por otro lado, el modelo de ajuste inducido propone que la adopción de una conformación preferida ocurre luego del evento de unión al ligando, en un proceso que puede involucrar, en el caso de IDPs, cambios conformacionales y transiciones orden-desorden. Cualquiera sea el modelo apropiado para explicar la biología de una proteína determinada (Hammes, Chang, Oas, 2009), la pre-existencia de conformaciones escasamente pobladas competentes o la reestructuración conformacional posterior a la unión de ligando, trae aparejada la noción que las IDPs no son proteínas completamente desestructuradas (Berlow et al., 2015) y que existen determinadas conformaciones que contienen información estructural residual que juega un papel clave en la función biológica de dicha proteína (Berlow et al., 2015; Davey, 2019; Reisen, Weisel, Kriegl, Schneider, 2010; Mészáros et al., 2019; Zea et al., 2016).

El conjunto de datos utilizado en este trabajo consistió en 310 estructuras de IDPs obtenidas por NMR. Estas proteínas contienen al menos el 40% de sus posiciones desordenadas (para una explicación más detallada sobre la estimación de desorden, véase la sección “Métodos”). La Figura 1 ilustra una estructura típica de una IDP distinguiendo entre regiones ordenadas (en color azul) y desordenadas (rojo). De la comparación entre las velocidades de evolución normalizadas de ambos tipos de regiones, presentes en todo el conjunto de datos, se puede deducir que las regiones desordenadas de las IDPs tienen tasas de evolución significativamente más altas que las regiones ordenadas de las mismas proteínas (Figura 2).

Figura 1: Representación de unensemble IDPs. Ambas figuras son una representación hecha con el software PyMol de la misma proteína promotora de polimerización de tubulina de humanos (TPPP3 código PDB: 2JRF). En la figura de la izquierda se resaltan en color rojo las posiciones desordenadas mientras que en el lado derecho de la figura se muestran las posiciones ordenadas en color azul.

Figura 2: Diagrama de cajas representando la distribución de las velocidades de evolución normalizadas por posición. Dentro del conjunto de datos entero de IDPs, las velocidades normalizadas para las posiciones desordenadas se muestran en color rojo (mediana de 0.95) y las posiciones ordenadas en azul (mediana de 0.65). Para las comparaciones estadísticas se realizó un test de Wilcoxon, los asteriscos representan valores de distinta significancia: ****, valores-p <= 0.0001; ***, valores-p <= 0.001; **, valores-p <= 0.01; *, valor-p <= 0.05; y la expresión “ns” (no significativo) implica que se obtuvo un valor-p > 0.05.

Esta heterogeneidad observada en las velocidades de evolución de IDPs se comprende mejor si se estudia cuál es la relación de los perfiles de velocidades posición-específica con la variación estructural observada en el ensemble proteico. Se observa que las velocidades de evolución por sitio muestran una alta correlación con su variación estructural en el ensemble, medida con el parámetro RMSF (Root Mean Square Fluctuation) de sus carbonos alfa como se muestra en la Figura 3. Cada panel de la figura colecta proteínas que presentan un arreglo estructural de desorden determinado (para más información sobre las proteínas utilizadas, véase la descripción y los paneles de la derecha de la Figura 3) y que por lo tanto presentan perfiles de velocidad de evolución similares (véase Figura 3, panel izquierdo) así como también perfiles de RMSF similares (véase Figura 3, panel central). Cabe destacar que las proteínas representadas en cada panel no son homólogas entre sí: son proteínas funcional y secuencialmente alejadas que, sin embargo, poseen la misma organización estructural en cuanto al patrón de orden-desorden.

Figura 3: Perfiles de velocidad normalizada y de RMSF. A la izquierda se grafican perfiles de velocidad de evolución normalizada; en el centro, perfiles del RMSF normalizados; a la derecha, proteína representativa de cada uno de los arreglos estructurales encontrados. En color azul se destacan las curvas obtenidas por regresión LOESS. Los perfiles en gris corresponden a las cadenas proteicas para cada grupo y, debajo, los códigos PDB. Marcadas con asteriscos están las proteínas utilizadas para la representación esquemática que se muestra a la derecha de cada panel. Panel A: proteínas que presentan un arreglo estructural del tipo desorden-orden (PDBids: 2cqrA, 2k3aA, 2khmA, 2myxA, 2rsmA, 2rsoA, *2rvlA). Panel B: proteínas que presentan un arreglo estructural del tipo orden-desorden (PDBids: 1uffA, 1ug1A, 1jvrA, *2hmxA, 2k4kA, 2k5fA, 2ru8A). Panel C: proteínas que presentan un arreglo estructural del tipo desorden-orden-desorden (PDBids: 1ixdA, *1u6fA, 1wj7A, 2dh7A, 2ecbA, 2ejmA, 2k8pA). Panel D: proteínas que presentan un arreglo estructural del tipo orden-desorden-orden (PDBids: 1qu6A, 2adzA, 2lbcA, 2l3sA, *2mphA). Panel E: proteínas que presentan un arreglo estructural complejo (PDBids: 1mm4A, 1sm7A, 1tteA, 1vzsA, *2aivA, 2afjA, 2n1rA).

Si se observa el panel de la derecha de la Figura 3, se pueden ver representaciones esquemáticas de proteínas con determinados arreglos estructurales. Es importante destacar que las regiones desordenadas pueden encontrarse en distintas partes de las proteínas: en la parte central o en los extremos (entiéndase por extremos amino o carboxilo terminal los correspondientes a la proteína o bien a los límites entre dominios, ya que un tercio de los polipéptidos presentes en el conjunto de datos son dominios que se encuentran presentes en la estructura de al menos 30 residuos de los extremos de la proteína). Estos perfiles de velocidad de evolución pueden ser utilizados para distinguir como mínimo cinco tipos distintos de organizaciones estructurales en proteínas:

1)

Proteínas que contienen una región N-terminal desordenada seguida de una región globular (panel A de la Figura 3). Como representante de este grupo se tomó al dominio N-terminal de la heterocromatina 1 de murino (Shimojo et al., 2016) (código PDB: 2RVL). El extremo N-terminal de esta proteína es polianfolítico y su flexibilidad es regulada por la fosforilación de sus serinas, lo que altera la distribución del ensemble conformacional, desplazándolo hacia aquellos confórmeros donde hay unión con la histona H3. Si se observa el lado izquierdo del panel A, se verá que las velocidades de evolución son más altas en la región de alta flexibilidad, que en este caso se corresponde con el extremo amino terminal.

2)

Proteínas que contienen una región N-terminal ordenada seguida de una región desordenada (panel B de la Figura 3). En este caso se tomó como representante para la esquematización el dominio alfa-hélice del precursor de la poliproteína Gag del HIV-1 (código PDB: 2HMX). En esta poliproteína, la región desordenada une MA al dominio N- terminal de la proteína CA. Recientemente se sugirió que la contracción de ese conector (linker) desordenado puede permitir la interacción entre la MA (inmadura) y el dominio CA, regulando la accesibilidad de la proteasa viral para la liberación de proteínas maduras (Samsudin, Gan, Bond, 2020). Al igual que el grupo anterior, estas proteínas presentan velocidades de evolución más altas en su extremo flexible, que en este caso es el extremo carboxilo terminal.

3)

Proteínas que presentan una organización estructural con una alternancia desorden-orden-desorden (panel C de la Figura 3). En este caso se tomó como representante a la proteína UBI-1 del parásito Trypanosoma cruzi. La proteína contiene un motivo de reconocimiento de RNA flanqueado por regiones N-terminal y C-terminal desordenadas (código PDB: 1U6F) (Volpon, D’Orso, Young, Frasch, Gehring, 2005). La región ordenada es evidenciada por una disminución concomitante tanto en el perfil de velocidad como en el de flexibilidad.

4)

Proteínas que presentan una organización estructural con una alternancia orden-desorden-orden (panel D de la Figura 3). Como representante de este grupo se tomó a la inmunofilina nuclear FKBP25 (código PDB: 2MPH). Esta proteína presenta un dominio N-terminal HLH y un dominio C-terminal de unión a FK506 que se encuentran unidos por un conector largo y flexible que permite el correcto reconocimiento del ADN por cualquiera de los dos dominios globulares (Prakash, Shin, Rajan, Yoon, 2016).

5)

Proteínas que presentan una organización estructural de desorden complejo (panel E de la Figura 3). Estas proteínas se caracterizan por tener regiones desordenadas cortas, embebidas en dominios globulares o formando parte de regiones de transición orden-desorden. Como ejemplo, se muestra una representación de la proteína del poro nuclear de levaduras NUP116P (código PDB: 2AIV) (Robinson et al., 2005) que presenta regiones con estructura secundaria bien definida intercaladas con loops flexibles.

Efectos de los contactos entre residuos en las velocidades de evolución

Se ha establecido que la estructura de la proteína tiene un gran impacto en las velocidades de evolución (Echave, Spielman, Wilke, 2016). Las velocidades de evolución en posiciones ordenadas y desordenadas podrían estar condicionadas o podrían ser explicadas si se consideran el número de contactos entre residuos. El promedio de contactos por posición en posiciones ordenadas es de 3.44, mientras que para las posiciones desordenadas es de 1.75. Es decir, en promedio las posiciones ordenadas tienen el doble de contactos físicos que las posiciones desordenadas. Como se puede observar en la Figura 2, las posiciones desordenadas de las IDPs presentan tasas de evolución más altas pero, también, algunas pueden evolucionar tan lento como posiciones ordenadas. Entonces, ¿cómo es posible que a pesar de tener en promedio menor cantidad de contactos terciarios, las posiciones desordenadas puedan presentar tasas evolutivas comparables con las de posiciones ordenadas? Los ensembles de IDPs están formados por conformaciones que presentan una alta tasa de interconversión y que además son estructuralmente muy diferentes entre sí, por lo que la cantidad de contactos entre residuos para una determinada posición puede cambiar sustancialmente entre distintas conformaciones. Entonces, fue necesario derivar alguna métrica estructural que diera cuenta de la información presente en todo el ensemble. Una de esas métricas es el promedio de contactos por posición, que se calculó de la siguiente manera (Figura 4).

Figura 4: Esquema de cálculo del promedio de contactos a lo largo del ensemble El promedio de contactos se calcula simplemente promediando la cantidad de contactos observados para una determinada posición a lo largo del ensemble.

Figura 5: Velocidad de evolución normalizada en función del promedio de contactos

Los diagramas de caja muestran la distribución de la velocidad normalizada en función del promedio de contactos por posición a lo largo de todo el ensemble. Para las comparaciones estadísticas se realizó un test de Wilcoxon, los asteriscos representan: ****, valores-p <= 0.0001; ***, valores-p <= 0.001; **, valores-p <= 0.01; *, valor-p <= 0.05; y la expresión “ns” (no significativo) implica que se obtuvo un valor-p > 0.05.

Si se considera el promedio de número de contactos por posición a lo largo de todo el ensemble, se puede observar una tendencia negativa entre la velocidad de evolución normalizada y el promedio de contactos, independientemente si esa posición es ordenada o desordenada (Figura 5). También, es interesante notar que las posiciones ordenadas y las desordenadas tienden a presentar tasas de evolución similares cuando el número de contactos aumenta. Este mismo resultado se obtiene cuando se compara con el máximo, el mínimo y la moda en el número de contactos derivados de todo el ensemble (Figura 6).

Figura 6: Velocidad de evolución normalizada en función de información de contactos. Los diagramas de caja muestran las distribuciones de las velocidades de evolución normalizadas en función de distintas métricas estructurales. Cada una de estas métricas son derivadas del ensemble, como el máximo, el mínimo y la moda de contactos para una determinada posición a lo largo del ensemble. Para las comparaciones estadísticas se realizó un test de Wilcoxon, los asteriscos representan valores de distinta significancia: ****, valores-p <= 0.0001; ***, valores-p <= 0.001; **, valores-p <= 0.01; * , valor-p <= 0.05; y la expresión “ns” (no significativo) implica que se obtuvo un valor-p > 0.05.

Otra métrica estructural utilizada para caracterizar el comportamiento dinámico de las IDPs es el parámetro que se denomina “robustez” de contactos, que contabiliza la fracción de confórmeros con al menos un contacto por sitio. Entonces, una robustez o fracción de contactos del 50% significa que para esa posición la mitad de los confórmeros del ensemble están haciendo contacto. Para esta determinación no importa si esa posición realiza 4 contactos con otro residuo o 1, es contabilizada como una posición con al menos un contacto. El esquema del cálculo de dicha fracción se ilustra en la Figura 7.

Figura 7: Esquema de cálculo de robustez de contacto para un ensemble. Para el esquema se ejemplifica con un ensemble de 4 confórmeros. La robustez de contactos se expresa en porcentaje, pero en fracción es análoga. Es decir, una robustez de 0.5 equivale a una robustez del 50% y viceversa. Si una posición no establece ningún contacto con otros residuos, se le asigna un 0. Si una posición establece un contacto o más con otra posición, se le asigna un 1. La robustez de contactos se calcula contando para qué fracción del ensemble entero esa posición establece contacto. Por ejemplo, en el esquema, la posición 1 presenta solamente contactos en el confórmero 3, entonces la fracción de contactos se calcula como 1 dividido el total de confórmeros en el ensemble, que son 4, lo que arroja una robustez del 25%. Por otro lado, la posición 5 presenta contacto en el confórmero 2, 3 y el 4, dando lugar a una robustez del 75%.

Además, la fracción de contactos puede ser interpretada como la robustez que tiene esa posición para mantener al menos un contacto a lo largo del ensemble. Una posición que tiene contactos en el 70% de los confórmeros es más robusta que una posición que solamente la tiene en el 10%, y por eso se definió a esa fracción como robustez de contacto. Como era esperable, las posiciones desordenadas tienen en promedio valores más bajos de robustez de contactos (~0.67) que las posiciones ordenadas (~0.92). Esto significa que las posiciones ordenadas tienden a mantener los contactos a lo largo de todo el ensemble (Figura 8).

Figura 8: Distribución de la robustez de contactos. Las posiciones desordenadas se ilustran en color rojo y las ordenadas en azul.

Que las posiciones ordenadas tengan en promedio mayor robustez de contacto que las desordenadas era esperable debido a su naturaleza y al rol que tienen en el mantenimiento de una estructura tridimensional determinada, establecida principalmente por contactos terciarios entre residuos. Como puede verse en la Figura 8, existen posiciones desordenadas que también presentan valores altos de robustez, e incluso alrededor del 40% de ellas presenta un valor del 100%. Evidentemente, el mantenimiento de contactos en determinadas posiciones resulta importante a pesar de que una posición esté predicha como desordenada, ya que esa predicción no implica necesariamente una pérdida de características estructurales. El desorden es un elemento estructural y debe ser tenido en cuenta para entender el rol biológico de las IDPs.

Entonces, ¿cuál es la relación entre la velocidad de evolución y la fracción o robustez de contactos para las posiciones desordenadas? En una primera aproximación, la robustez de contactos puede entenderse como determinante si es que toma el valor 0 (ningún confórmero tiene contactos en esa posición) o el valor 100 (todos los confórmeros mantienen al menos un contacto en esa posición). Si se observa la Figura 9, se puede concluir que la necesidad de mantener al menos un contacto en el 100% de las conformaciones restringe la velocidad de evolución para esa posición. El desorden es también un elemento estructural que modula la divergencia secuencial.

En una primera aproximación, la heterogeneidad de las velocidades de evolución en las IDPs (véanse Figura 2, Figura 3, Figura 11) puede ser explicada como función de los contactos terciarios por posición en los distintos confórmeros del ensemble (véanse Figura 5, Figura 9, Figura 10, Figura 13). Estos resultados sugieren que el estado del arte y todo lo que se conoce hasta el momento en relación con las tasas evolutivas de proteínas globulares puede extenderse a proteínas que carecen de una estructura estable y definida como las IDPs. Sin embargo, este tipo de proteínas, como ya se describió, poseen ciertas particularidades. La mayor diferencia entre las proteínas globulares y las IDPs es la enorme diversidad estructural que las últimas presentan entre los distintos confórmeros que forman parte del ensemble nativo. Este comportamiento particular implica una variabilidad muy marcada en el número de contactos por sitio en cada confórmero.

Las variaciones en la cantidad de contactos por posición debido a cambios conformacionales fueron extensamente ignoradas en los estudios evolutivos (excepto en algunos ejemplos como Zea, Monzon, Fornasari, Marino-Buslje, Parisi (2013) y Sharir-Ivry, Xia (2017)). Pero, como se deduce de este artículo, son imposibles de negar en los ensembles de IDPs. Estas variaciones imponen restricciones acumulativas en las velocidades de evolución (Saldaño, Monzon, Parisi, Fernandez-Alberti, 2016) que podrían reflejar la importancia de las conformaciones transitorias o preferentes en el ensemble (Davey, 2019). Es posible que la heterogeneidad de la velocidad de evolución en regiones desordenadas se deba parcialmente a la presencia de módulos funcionales involucrados en interacciones proteína-proteína, unión a ligando o modificaciones post-traduccionales. Entre estos, los motivos lineales cortos (Short Linear Motivs, o SLiMs por sus siglas en inglés) son sitios típicos de interacción en IDPs, y usualmente se encuentran más conservados que los residuos a su alrededor (van der Lee et al., 2014). Si bien no se detectaron sitios de unión cuando se buscaron SLiMs conocidos en la base de datos ELM (Gouw et al., 2018), podrían existir conformaciones ‘predilectas’ que llegarían a contener estructuras secundarias residuales relacionadas con las interacciones entre proteínas.

El conjunto de datos utilizados se construyó a partir de IDPs que estuvieran depositadas en la PDB (Rose et al., 2015) y que, por lo tanto, su estructura fuese conocida y obtenida mediante técnicas de NMR. Para tal fin, se descargaron todos los archivos de coordenadas estructurales obtenidos por NMR y sobre ese conjunto se predijo el porcentaje de desorden con el método ESpritz (Walsh, Martin, Di Domenico, Tosatto, 2012) y se clasificaron como IDPs aquellas proteínas que tuviesen al menos un 40% de sus residuos predichos como desordenados. A continuación se obtuvieron alineamientos múltiples de proteínas homólogas presentes en la base de datos HSSP (Dodge, Schneider, Sander, 1998), filtrando y seleccionando aquellos MSA que tuviesen solo un ~5% de gaps en promedio por posición y con porcentajes de identidad entre el 33 y el 100% contra la secuencia de referencia de PDB, y que tuviesen una cobertura de al menos el 60% con esta última (median identity percentage de 64%). Los alineamientos utilizados tenían en promedio 96 secuencias y un promedio de de 7.38% de gaps en las posiciones. Para asegurarse que en el conjunto de datos consistía en proteínas que fueran menos del 50% idénticas, se utilizó el programa CD-HIT (Fu, Niu, Zhu, Wu, Li, 2012).Todas las proteínas que cumpliesen con estas condiciones fueron posteriormente inspeccionadas visualmente y se seleccionaron aquellas que tuviesen un contenido de desorden evidente en la estructura 3D. Este paso es importante porque los predictores pueden, como todo método, tener errores en la asignación de desorden. Además, en esta instancia se eliminaron proteínas quiméricas.

El conjunto de datos final y curado consistió en 310 IDPs, con una longitud promedio de aproximadamente 130 residuos (mínimo 58, máximo 37), y número promedio de confórmeros por ensemble de aproximadamente 20 (mínimo 6, máximo 60). En este conjunto de datos las regiones desordenadas que consisten de más de 5 residuos tienen una longitud promedio de 23.6 aminoácidos, con un máximo de 263. Pueden observarse algunas de las IDPs utilizadas para el estudio en la Figura 17.

Figura 17: Representación de IDPs presentes en el conjunto de datos. Códigos PDB: a) 1AP0_A, b) 1WWK_A, c) 1INZ_A, d) 1IXD_A, e) 2LXF_A, f) 2COY_A, g) 1EJ5_A, h) 2DGQ_A, i) 2BBU_A, j) 2JZ6_A, k) 2CP5_A, l) 2KPM_A, m) 2L9Y_A, n) 1JFN_A, o) 2N1I_A.

Para el cálculo de las velocidades de evolución se utilizó el programa Rate4Site (Pupko, Bell, Mayrose, Glaser, Ben-Tal, 2002) con los alineamientos descritos previamente. Este programa estima las velocidades de evolución sitio-específicas mediante métodos Bayesianos bajo la hipótesis de independencia entre los sitios, reconstruye un árbol filogénetico para las secuencias del MSA mediante un algoritmo de unión de vecinos (neighbor-joining y NJ por su sigla en inglés) y distancias estimadas por máxima verosimilitud. En este trabajo se utilizó el modelo de JTT (Jones, Taylor, Thornton, 1992). Para cada proteína, los valores de velocidad de evolución sitio-específicos crudos del Rate4Site se normalizaron dividiéndolos por el valor promedio de velocidad de la proteína entera tal como se indica en Sydykova, Wilke (2017). El test de Wilcoxon fue utilizado para evaluar las diferencias significativas en las medias de las velocidades de evolución normalizadas entre los subconjuntos de posiciones ordenadas y desordenadas.